6、重组AFB₁最优降解条件的漆酶确定

由表4可知，二次回归方程的降解接分结构解析模型极显著，且方程的黄曲回归系数R²为0.8992，因此方程的霉毒拟合度高，能够正确反映AFB₁降解率与孵育时间、分对孵育温度和酶活力之间的析及关系，通过DesignExpertv8.0.6软件分析AFB₁最大降解率对应的产物反应条件为孵育时间15.030h、孵育温度33.985℃、重组酶活力2.107U，漆酶预测值为91.866%，降解接分结构解析考虑实际操作，黄曲对应的霉毒孵育时间15h、孵育温度34℃、分对酶活力2U，析及得到的AFB₁降解率为91.08%，表明AFB₁降解率与预测值基本吻合，说明该模型可以预测AFB₁最大降解率。

7、AFB₁降解产物的总离子流色谱

如图7所示，AFB₁经漆酶降解后检测到4个新的色谱峰，由峰形和分离度可看出，各产物分离效果较好，且由保留时间不同推测降解产物不同。根据AFB₁和降解产物的保留时间判断5种物质的极性大小为A＞B＞C＞AFB₁＞D。

8、AFB₁降解产物的分子式及结构分析

为进一步确定4种降解产物的结构式，利用Q-TOF-MS进行分析。在整个反应体系中，AFB₁只含C、H、O3种元素，酶的本质为蛋白质，利用酶降解则可能引入N元素。利用采集到的各降解产物的质谱数据，分析预测各产物可能的元素组成和分子式，如表5所示。

AFB₁主要由4个不同的降解作用位点:1）香豆素内酯环不稳定，在外界条件下会脱羰基）能与核酸、蛋白质等结合的呋喃环双键和H₂O、H等发生加成反应。3）环戊烯酮环通过加成反应、取代反应影响AFB1的毒性。4）苯环上的-0CH₃可以与-OH、H、-CHO发生取代反应。同时，AFB₁的部分降解产物之间可以相互转化。如图8A所示，降解产物A在碰撞中产生[M+H]⁺为m/z279.0932的前体离子，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C₁₆H₂₂O₄，同时产生[M+H]⁺为m/z201.0465、149.0236、121.0311的特征碎片离子。根据二级质谱特征离子m/z149，并利用Scifinder和Reaxy数据库检索。由降解产物A的特征碎片离子[M+H]⁺为m/z149.0236推测的结构与Samuel等解析出的Pseudomonasputida降解AFB₁得到的AFD3产物结构一致，并且经实验验证该物质对Hela细胞的毒性远小于AFB₁。如图8B所示，降解产物B在碰撞中产生[M+H]⁺为m/z245.1282的前体离子，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C₁₄H₁₆N₂O₂，同时产生[M+H]⁺为m/z217.1332、120.0811、154.0735、70.0680的特征碎片离子。根据二级质谱特征离子m/z271，推测该化合物结构中存在一个羰基，并利用Scifinder和Reaxy数据库检索。如图8C所示，降解产物A在碰撞中产生[M+H]⁺为m/z197.1145的前体离子，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C₇H₁₂N₆O₁同时产生[M+H]⁺为m/z70.0678的特征碎片离子。根据二级质谱特征离子，推测该化合物中有吡咯烷结构，并利用Scifinder和Reaxy数据库检索。如图8D所示，降解产物C在碰撞中产生[M+H]⁺为m/z415.2427的前体离子，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C₂₄H₃₀O₆，同时产生[M+H]⁺为m/z397.1455、109.0863的特征碎片离子。根据二级质谱特征离子m/z397和m/z109，推测该化合物结构中存在一个羟基和苯甲醇结构单元，并利用Scifinder和Reaxy数据库检索。AFB₁经漆酶降解后的各产物结构见图9。

有研究表明连续损失-CO是AFB₁的主要的碎裂途径，苯环上的甲氧基也会发生甲苯和甲醇丢失。根据降解方式的不同，AFB₁可发生羟基化、环氧化、还原和脱氢等反应。AFB₁的微生物降解主要涉及毒素呋喃环或香豆素内酯环结构的修饰，这2种结构是AFB₁具有高致癌性和高毒性的主要原因。WangJianqiao等首次报道锰过氧化物酶可以通过将AFB₁转化为AFB₁-8，9-二氢二醇而有效去除AFB₁的诱变活性。LiJianlong等利用耐盐CandidaversatilisCGMCC3790降解AFB₁得到4种降解产物，推测AFB₁有2种降解途径，一种是内酯环和苯环被水解，另一种是通过加氢破坏内酯环的酯键和醚键。Samuel等19发现AFB₁的呋喃环、内酯羰基和环戊烯酮环被Pseudomonasputida修饰、破坏而转化成不同结构的化合物。

Afsharmanesh等22发现F₄₂₀H₂还原酶可以催化α-和β-不饱和酯部分的双键还原，BacC氧化还原酶可以催化香豆素内酯环双键水解产生羧酸，随后发生脱羧基反应生成产物。

酶降解体系复杂，漆酶在整个体系中发挥催化作用，裂解成包含-NH2、R-NH2等官能团的小分子多肽、氨基酸等化合物，可以与AFB₁的活性位点发生加成、取代等一系列反应，因此AFB₁的降解路径较为复杂。本实验得到的4种降解产物均不含呋喃环双键、香豆素内酯环和环戊酮烯环，且所含双键数量均小于AFB₁可能在AFB₁分子的上述毒性部位通过加成、取代或氧化反应产生了新的支链。降解产物A（C₁₆H₂₂O₄）比AFB₁少一个-CO₂，多10个H，推测可能为AFB₁丢失-CO后发生脱羰基反应，结构中的双键与H原子发生加成。降解产物B（C₇H₁₂N₆O）和C（C₁₄H₁₆N₂O₂）均含有N元素，可能是体系中的含N小分子化合物参与反应，且发现相近的裂解碎片，推测可能为AFB1发生连续的-CO丢失后，与H₂O和-NH₂发生加成和取代反应，生成产物C和D。推测降解产物D（C₂₄H₃₀O₆）的生成途径为呋喃环双键发生加成反应而断裂，连续丢失-CO，双键与H₂O和H发生加成反应。

AFs的毒性和致癌机制已经被广泛研究，主要与二氢呋喃环和香豆素结构有关，通过对本研究降解产物结构的分析，发现呋喃环双键和香豆素内酯环均被破坏，因此推测漆酶降解AFB₁得到的产物毒性显著低于亲本毒素。也有研究表明AFB₁经漆酶处理后，呋喃环双键或内酯环裂解，产物的荧光性和诱变性减弱，且未检测到与AFB₁相近的结构类似物。但是由于漆酶的来源、降解条件存在差异性，也可能造成降价产物的毒性存在差异，需要进行体外细胞毒性、遗传毒性实验以及体内动物实验进一步验证，评估降解产物的安全性。

本研究选择与栓菌漆酶lac3基因同源性最高的3KW7作为模板进行同源模建，将AFB₁对接到漆酶的活性部位，结果显示漆酶与AFB₁可以相互作用，氢键是关键作用力，表明漆酶可用于AFs的降解。通过实际的降解实验验证，响应面优化获得AFB₁降解率最优的条件为应时间15h，孵育温度34℃，酶活力2U，降解率可达91.08%。在此条件下利用UPLC-Q-TOF-MS分析AFB₁降解产物结构，发现4个主要降解产物，根据其二级质谱信息和精确分子质量，推测出降解产物的分子式分别为C₁₆H₂₂O₄、C₁₄H₁₆N₂O₂、C₇H₁₂N₆O和C₂₄H₃₀O₆。

本实验只针对最优降解条件下产物的生成途径及结构进行解析，对于不同降解条件下产物的差异性未进行探讨，蛋白酶的来源及作用时间、温度和酶活力等外界因素可能会影响降解途径及产物结构，需进一步进行分析研究。国外对黄曲霉生物脱除的研究较多集中在乳酸菌、放线菌和一些真菌中如树状指孢霉（Dactyliumdendroide）、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）、糙皮侧耳（Pleurotusostreatus）、茎点霉（Phomasp）、白腐菌变色栓菌（Trametesversicolor）等。对乳酸菌的研究多数认为乳酸菌降解AFB₁是通过生物吸附作用，Eshelli等研究了放线菌对AFB₁降解推断其降解途径可能和脂肪酸及糖酵解中间产物的累积有关，而对真菌的研究表明其对AFB₁的降解多数为生物降解，主要通过微生物分泌蛋白酶的酶促反应；如左振宇、杨文华等分别从真菌假蜜环菌（Armillariellatabescens）、黏细菌（Myxococcusfulvus）、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）F4中得到了能降解AFs的蛋白酶，前两者还尝试了其在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达，并进行一些酶学基本性质的分析。总的来说，目前已经发现能使AFs含量降低包括细菌、真菌和酵母菌在内的大约有上千种微生物，但是多数的研究主要侧重在AFs降解菌株的筛选和粗提液降解能力的分析上，对于不同微生物来源的蛋白酶的性质、结构和底物作用模式、降解机理、产物结构及降解产物毒性的认识仍缺乏深入的研究与探讨。这可能与微生物产酶量低，分离纯化困难，酶性质不稳定及作用条件苛刻等原因有关。但随着生物化学、分子生物学、基因工程及酶工程等技术的发展成熟，人们对酶的认识越来越清晰，重组载体构建、异源表达、电子自旋共振、同源模建、分子模拟、晶体结构解析等手段的建立使上述研究过程中的瓶颈可能得以突破，有更多的手段和方法解析问题背后的本质。
 

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